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  热带亚热带植物学报  2018, Vol. 26 Issue (2): 197-201  DOI: 10.11926/jtsb.3842
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引用本文  

卜淼淼, 韩德建, 董存柱. 朱砂莲果实化学成分杀南方根结线虫活性研究[J]. 热带亚热带植物学报, 2018, 26(2): 197-201. DOI: 10.11926/jtsb.3842.
BU Miao-miao, HAN De-jian, DONG Cun-zhu. Nematicidal Activity of Chemical Compositions from Aristolochia tuberosa Fruits against Root-knot Nematode[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 2018, 26(2): 197-201. DOI: 10.11926/jtsb.3842.

基金项目

国家自然科学基金项目(31360447);海南省重点研发计划项目(ZDYF2016157)资助

通信作者

董存柱, E-mail:czd@hainu.edu.cn

作者简介

卜淼淼(1992~), 女, 硕士研究生, 研究方向为天然产物化学。E-mail:shwjeyyll@outlook.com

文章历史

收稿日期:2017-10-30
接受日期:2017-12-30
朱砂莲果实化学成分杀南方根结线虫活性研究
卜淼淼 , 韩德建 , 董存柱     
海南大学热带农林学院, 海口 570228
摘要:为了解朱砂莲(Aristolochia tuberosa O.F.Liang et S.M.Huang)的化学成分,从其果实的甲醇提取物中分离得到4个化合物。通过波普数据分析,分别鉴定为马兜铃内酰胺W(1)、8-epidiosbulbin e acetate(2)、diosbulbin B(3)和β-sitosterol(4)。化合物1~3对南方根结线虫2龄幼虫具有不同程度的毒杀作用,尤其马兜铃内酰胺W(1)活性最好,其96 h后的LC50为119.94 μg mL-1。马兜铃属植物具有开发为新型植物源杀根结线虫剂的潜在价值。
关键词朱砂莲    果实    化学成分    南方根结线虫    杀根结线虫活性    
Nematicidal Activity of Chemical Compositions from Aristolochia tuberosa Fruits against Root-knot Nematode
BU Miao-miao , HAN De-jian , DONG Cun-zhu     
Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China
Foundation item: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31360447), and the Project for Key Research and Development in Hainan (Grant No. ZDYF2016157)
Abstract: In order to understand the bioactivity constituents from Aristolochia tuberosa O. F. Liang et S. M. Huang, four compounds were isolated from methanol extract of A. tuberosa fruits by using silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 gel column chromatography, precipitation and recrystallization methods. On the basis of spectral data, their structures were identified as aristololactam W (1), 8-epidiosbulbin e acetate (2), diosbulbin B (3) and β-sitosterol (4). Furthermore, nematicidal activity of four compounds against the second stage juvenile (J2) of Meloidogyne javanica were analyzed. The compounds 1-3 exhibited obviously toxic effects on J2 of M. javanica in vitro, especially for aristololactam W with the LC50 values of 119.94 μg mL-1 after 96 h. So, Aristolochia species have the potential value of developing new plant source to control root nematodes.
Key words: Aristolochia tuberosa    Fruit    Phytochemistry    South root knot nematodes    Nematicidal    

朱砂莲(Aristolochia tuberosa O. F. Liang et S. M. Huang)为马兜铃科(Aristolochia)马兜铃属多年生草本植物, 主要分布在中国西南地区的广西、云南等地, 民间广泛用于治疗喉痛、腹痛、胃痛、痢疾、肺痨、蛇伤等[1]。近年来, 国内外关于马兜铃属植物的化学成分及生物活性的研究十分活跃。目前报道的化学成分包括马兜铃酸及其内酰胺衍生物、生物碱和萜类化合物等[1-2]; 其中马兜铃酸及其内酰胺衍生物类化合物是主要的活性化合物, 目前关于其药理活性的研究也主要集中在马兜铃酸及其内酰胺衍生物的医用活性方面[2-3], 但随着马兜铃酸具有“肾毒作用”的发现被医学上弃用[3], 转而向农用上抑制种子萌发[4]、杀虫[5]等方面。经查阅国内外文献发现, 关于马兜铃属植物抑制根结线虫的研究没有相关报道; 关于朱砂莲的相关报道主要集中在医药制剂[6]、炮制[7]、镇痛[8]、肾毒[9]等方面, 其化学成分的相关报道较少[10-13]。因此, 本研究为了进一步确定朱砂莲的化学成分及抑制根结线虫活性, 对朱砂莲果实的化学成分进行了系统的分离鉴定, 并对南方根结线虫2龄幼虫的体外活性进行了系统评价, 以期为根结线虫的防治提供新的选项。

1 材料和方法 1.1 材料

朱砂莲(Aristolochia tuberosa O. F. Liang et S. M. Huang)果实于2015年5月购自安徽省亳州市皖北赵氏药业, 由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王清隆鉴定, 标本(Gd-2015-05)保存于海南大学热带农林学院天然产物研究实验室。供试2龄南方根结线虫由海南大学热带农林学院化保实验室提供。

1.2 仪器和试剂

Bruker DRX-400型核磁共振波谱仪(TMS为内标德国Bruker公司); Nikon SMZ745T型显微镜(日本Nikon公司); 凝胶Sephadex LH-20 (美国GE公司生产); 柱色谱用硅胶(200~300目), 拌样用硅胶(60~80目)以及薄层色谱(TLC)用预制硅胶GF254均为青岛海洋化工厂集团公司产品; 柱层析试剂规格均为国产分析纯, 购自西陇科学股份有限公司。

1.3 提取和分离

朱砂莲果实10 kg经干燥粉碎, 用10 L甲醇避光冷浸提3~5次, 合并提取液减压浓缩得总浸膏; 甲醇浸膏溶于5 L蒸馏水, 依次加入3 L石油醚、3 L三氯甲烷各萃取3~5次, 减压浓缩得石油醚萃取物浸膏36 g、三氯甲烷萃取物浸膏40 g。石油醚浸膏与60~80目硅胶1:1拌样, 经200~300目硅胶柱层析梯度洗脱[石油醚-丙酮为99:1 (V/V, 下同), 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 55:45, 45:55, 35:65, 25:75, 10:90], 基于TLC检测合并成A~I共9个部分, B和D部分进而凝胶柱层析(甲醇-氯仿为50:50)得到化合物1 (42 mg)和化合物4 (32 mg); 氯仿浸膏采用石油醚-丙酮系统、丙酮-甲醇系统以同样的梯度洗脱, 得到J~Q共8个部分, K和M部分进行凝胶柱层析(甲醇-氯仿为50:50)得到化合物2 (884 mg)和化合物3 (684 mg)。

1.4 抑制南方根结线虫2龄幼虫活性测定

取20 mg单体化合物加入200 μL DMSO和吐温-80, 经混合、超声、加热充分溶解, 用超纯水定容至10 mL, 分别取1 mL混合溶液和1 mL的线虫悬浮液(约100条2龄线虫)倒入12孔板中, 最终测试物的浓度为200 μg mL-1。DMSO溶剂含量不超过0.5%, DMSO和吐温-80混合溶剂则不超过1%, 以同样含量的DMSO、吐温-80混合溶剂作为对照(control), 放置于25℃培养箱内, 每组处理重复3次。分别在24、48、72、96 h后于解剖镜下观察线虫的活力, 线虫僵直不动且在清水中4 h内不能恢复活动视为死亡, 记录每组处理的存活数和死亡数, 死亡率由校正死亡率计算:校正死亡率(%)=[处理组死亡率(%)-对照组死亡率(%)]/[1-对照组死亡率(%)]。

具有良好活性的化合物(死亡率 > 50%)需要进一步的评估, 用同样方法将化合物稀释成系列浓度200、100、50、25和12.5 μg mL-1进行毒力测定, 计算半致死浓度(LC50)。采用DPS 9.0软件进行数据统计分析, 用Origin Pro 8.5软件作图。

1.5 结构鉴定

化合物1  淡黄色针晶。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.25 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5), 7.70 (1H, s, H-9), 7.63 (1H, s, H-2), 7.49 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-6), 7.06 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-7), 6.38 (2H, s, H-14), 5.39 (2H, s, H-12), 4.03 (3H, s, 8-OCH3), 3.41 (3H, s, H-13); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 168.0 (C-11), 156.0 (C-8), 149.0 (C-3), 148.0 (C-4), 134.9 (C-10), 126.2 (C-10a), 126.1 (C-6), 125.2 (C-4b), 124.6 (C-8a), 119.5 (C-5), 118.4 (C-1), 112.1 (C-4a), 107.8 (C-7), 106.3 (C-2), 102.9 (C-14), 99.5 (C-9), 71.4 (C-12), 56.3 (8-OCH3), 55.7 (C-13)。以上数据与文献[14]报道一致, 故鉴定为马兜铃内酰胺W。

化合物2  白色针晶。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.51 (1H, dt, J = 1.6, 0.8 Hz, H-16), 7.42 (1H, d, J = 1.7 Hz, H-14), 6.44 (1H, dd, J = 1.9, 0.9 Hz, H-15), 5.53 (1H, dd, J = 12.7, 3.3 Hz, H-12ax), 5.15 (1H, q, J = 2.7 Hz, H-6eq), 4.91~4.84 (1H, m, H-2ax), 2.82 (1H, ddd, J = 15.1, 3.1, 2.0 Hz, H-7ax), 2.61 (1H, dd, J = 12.1, 5.8 Hz, H-4ax), 2.57 (1H, dd, J = 3.4, 2.1 Hz, H-3ax), 2.52 (1H, ddd, J = 11.4, 5.6, 1.7 Hz, H-11eq), 2.34 (1H, dd, J = 6.1, 2.0 Hz, H-8eq), 2.15 (1H, t, J = 4.2 Hz, H-11ax), 2.11 (1H, dd, J = 8.0, 3.9 Hz, H-1ax), 2.00 (3H, s, O-C-CH3), 1.96~1.90 (1H, m, H-5eq), 1.90~1.83 (1H, m, H-7ax), 1.82~1.79 (1H, m, H-1eq), 1.78 (1H, d, J = 5.8 Hz, H-3eq), 1.49 (1H, ddd, J = 13.4, 11.9, 1.1 Hz, H-1eq), 1.16 (3H, s, 19-CH3); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 176.0 (C-19), 170.9 (C-17), 143.8 (C-16), 139.9 (C-15), 124.9 (C-13), 108.4 (C-14), 76.6 (C-2), 69.5 (C-6), 45.9 (C-8), 42.1 (C-10), 41.2 (C-5), 39.7 (C-11), 38.6 (C-3), 34.5 (C-9), 31.6 (C-4), 28.3 (C-1), 26.8 (C-7), 21.9 (C-21), 21.0 (C-19)。以上数据与文献[15]报道一致, 故鉴定为8-epi-diosbulbin e acetate。

化合物3  白色针晶。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.68 (1H, dt, J = 1.4, 0.6 Hz, H-16), 7.58 (1H, t, J = 1.7 Hz, H-15), 6.86 (1H, dd, J = 2.0, 0.8 Hz, H-14), 5.24 (1H, dd, J = 10.9, 5.4 Hz, H-12), 4.84 (1H, t, H-2), 4.77 (1H, d, J = 5.7 Hz, H-6ax), 2.73 (1H, d, J = 5.2 Hz, H-4), 2.44 (1H, dd, J = 6.0, 5.0 Hz, H-7eq), 2.42~2.37 (1H, m, H-3eq), 2.18 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-5), 2.15 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7ax), 2.05~1.96 (1H, m, H-11eq), 1.93 (1H, s, H-3ax), 1.90~1.85 (1H, m, H-1ax), 1.81 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-11ax), 1.66 (1H, s, H-1eq), 1.65~1.60 (1H, m, H-6eq), 1.18 (3H, s, 19-CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6): δ 176.6 (C-17), 143.6 (C-15), 141.4 (C-16), 126.4 (C-13), 110.7 (C-14), 89.8 (C-8), 79.8 (C-6), 79.4 (C-2), 77.6 (C-12), 45.9 (C-9), 42.0 (C-11), 41.9 (C-4), 41.5 (C-5), 39.0 (C-10), 38.8 (C-3), 37.2 (C-7), 29.3 (C-1), 16.7 (C-19)。以上数据与文献[16]报道一致, 故鉴定为diosbulbin B。

化合物4  白色针晶。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.35 (1H, dt, J = 5.4, 2.0 Hz, H-6), 3.53 (1H, ddd, J =11.1, 5.3, 4.1 Hz, H-3), 1.01 (3H, s, 19-CH3), 0.94~0.91 (3H, m, 21-CH3), 0.85 (3H, d, J = 7.5 Hz, 29-CH3), 0.82 (3H, d, J = 1.9 Hz, 26-CH3), 0.82~0.76 (3H, m, 27-CH3), 0.68 (3H, s, 18-CH3)。13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 140.8 (C-5), 121.8 (C-6), 71.9 (C-3), 56.8 (C-14), 56.1 (C-17), 50.2 (C-9), 45.9 (C-24), 42.4 (C-13), 42.3 (C-4), 39.8 (C-12), 37.3 (C-1), 36.5 (C-10), 36.2 (C-20), 34.0 (C-22), 32.0 (C-7), 31.9 (C-8), 31.7 (C-2), 29.2 (C-25), 28.3 (C-16), 26.1 (C-23), 24.3 (C-15), 23.1 (C-28), 21.1 (C-11), 19.9 (C-26), 19.4 (C-19), 19.1 (C-27), 18.8 (C-21), 12.0 (C-18), 11.9 (C-29)。以上数据与文献[17]报道一致, 故鉴定为β-sitosterol。

图 1 化合物1~4的结构 Fig. 1 Structure of compounds 1-4
1.6 活性测试结果

表 1可见, 200 μg mL-1的化合物1~3对南方根结线虫2龄幼虫具有不同程度的毒杀活性, 处理96 h后的杀死率分别为58.55%、32.70%和25.30%。显然, 马兜铃内酰胺W (1)对南方根结线虫2龄幼虫的活性高于化合物23

表 1 200 μg mL–1化合物1~4对2龄南方根结线虫的毒杀活性(%) Table 1 Nematicidal activities (%) of compounds 1-4 at 200 μg mL–1 against J2 Meloidogyne incognita

图 2可见, 不同浓度马兜铃内酰胺W (1)的杀南方根结线虫2龄幼虫活性均随时间增加而增强; 处理相同时间, 随浓度增加其毒杀作用增强, 且增加的幅度也逐步增大, 以200 μg mL-1增加幅度最大。线性回归分析结果表明, 马兜铃内酰胺W (1)对南方根结线虫2龄幼虫的毒力在96 h后呈现清晰的剂量-效应关系, 相关性良好(r=0.99), 毒力回归方程为Y=0.7810x+3.3764, LC50值为119.94 μg mL-1

图 2 马兜铃内酰胺W对2龄南方根结线虫的毒杀活性 Fig. 2 Nematicidal activities of aristololactam W against J2 Meloidogyne incognita
2 结论和讨论

朱砂莲又称避蛇雷, 始载于《唐本草》, 民间作为止痛、触虫蛇毒, 应用已有上千年的历史。本研究采用色谱柱层析分离手段, 从朱砂莲果实甲醇提取物中分离得到了4个化合物, 经波普数据分析, 他们的结构被鉴定为马兜铃内酰胺W (1)、8-epi-diosbulbin e acetate (2)、diosbulbin B (3)和β-sito-sterol (4), 其中化合物1~3均为首次从朱砂莲中分离得到。体外杀南方根结线虫活性结果表明, 化合物1~3对南方根结线虫2龄幼虫均具有一定程度的杀死作用, 尤其是马兜铃内酰胺W在96 h后的LC50为119.94 μg mL-1, 可作为天然潜在的新杀根结线虫剂来开发。据文献报道, 朱砂莲的药理活性集中在医学应用方面, 且药理活性研究大多局限于粗提物, 而具体的农用活性及其作用机制尚不明确, 本研究对马兜铃属植物的化学成分毒杀南方根结线虫的活性为首次报道, 同时, 化合物1的活性研究尚没有相关报道, 化合物23均具有较强的急性肝细胞毒[18-19]等活性。本研究结果对于开发新型植物源杀根结线虫剂具有潜在价值; 同时, 丰富了朱砂莲的化合物库, 为深入挖掘该植物的活性成分及药用价值提供了一定的前期研究基础, 并对于马兜铃属生物资源的再开发和深度应用具有重要意义。

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